7月1日，福建農林大學廖紅/陳志長團隊在Nature Communications發表了題爲“A natural uORF variant confers phosphorus acquisition diversity in soybean”的研究論文，發現並證實位于基因5’UTR開放閱讀框（uORF）的一個堿基變異導致了大豆群體磷吸收效率水平的多樣性。
該研究利用前期收集的大豆磷效率應用核心種質資源，開展了全基因組重測序獲得了高密度的分子標記；並開展了田間表型鑒定，獲取了磷效率相關的表型指標。然後針對植株磷含量進行了全基因組關聯分析（GWAS），沒有鑒定到顯著且背景幹淨的關聯信號；考慮到磷含量與植株總根長的相關性，爲了提高GWAS的檢測力，研究者引入總根長作爲協變量再次對磷含量進行GWAS, 發現在20號染色體上出現了一個新的顯著關聯位點。研究者推斷該位點不影響根長，是通過影響根的吸收效率從而影響磷的吸收量。基于此衍生了一個新的磷吸收效率的表型指標，即單位根長的磷吸收量（植株磷含量/總根長），針對該指標開展GWAS，鑒定到一個顯著且背景幹淨的關聯信號，正是上述位于20號染色體的位點，命名爲CPU1 (component of phosphorus uptake 1)。
通過對位點內基因的組織表達譜信息調查和序列同源分析，初步確定SEC12-like蛋白的編碼基因GmPHF1爲CPU1位点的候选基因。爲了确定该基因的功能，分别构建了大豆RNAi和超表達穩轉材料，並進行磷效率表型分析，結果顯示該基因影響根的磷吸收效率而不影響總根長；進一步通過LA-ICP-MS證實了該基因在磷吸收方面的功能。GmPHF1與其水稻和擬南芥同源基因一致，蛋白定位于細胞內質網。位于細胞內質網的蛋白是如何影響根從土壤中吸收磷？研究者通過毛根轉化和穩定轉化發現並證實了GmPHF1與根中特異高表達的磷轉運蛋白GmPT4之間的遺傳關系。進一步通過免疫染色發現GmPHF1幫助GmPT4從根表皮細胞內質網轉移至細胞膜；同時研究者發現了GmPT4是以極性的方式定位于細胞膜，行使其從土壤中吸收磷的功能。
GmPHF1的功能變異位點在哪裏？是表達量的變異還是氨基酸序列的變異？研究者開展了GmPHF1候選基因關聯分析，發現關聯信號集中在啓動子和5’UTR。基于這些顯著的變異位點將該基因分成了兩種主要的單倍型：與磷低效單倍型（H1）相比，高效單倍型（H2）提高根的磷吸收效率達38.64%。進一步分析發現5’UTR内含有一个開放閱讀框（uORF），存在的兩個顯著SNPs (SNP476和SNP413)正好位于該uORF，SNP476導致氨基酸的變化，SNP413引入終止密碼子，導致uORF的提前終止（高效單倍型（H2）和低效單倍型（H1）分別對應著120 bp和84 bp的uORF）。兩個SNP完全連鎖不平衡(r2=1)且是高頻變異位點（MAF=0.49）。研究者構建了不同單倍型啓動子和5’UTR的重組載體，通過Western試驗和免疫染色試驗證實了功能變異位點存在于5’UTR，含有較長uORF的H2單倍型對應著較高的GmPHF1蛋白含量。
最終引起變異的是5’UTR中哪一個SNP，還是兩個SNPs同時發揮作用？SNP影響下遊GmPHF1的翻譯是否依賴uORF？爲了解决这个问题，研究者构建两个SNPs不同基因型的重組載體，結果發現導致uORF長度變化的SNP413才是真正的功能变异位点。当人爲突变uORF的起始密碼子（ATG→AAA），無論SNP413是哪一種基因型，都無法檢測到下遊GmPHF1的翻譯，說明SNP413是通過uORF來調控下遊GmPHF1的翻譯。免疫染色結果顯示SNP413不僅影響蛋白的翻譯量還影響著其空間分布, 這可能與uORF的組織特異性相關。最終研究者通過遺傳穩定轉化，將GmPHF1的高效等位基因轉入到大豆中，大豆的磷吸收效率得到顯著提高，直接證實了SNP413在表型上的功能，也顯示了其在育種方面的價值。
綜上所述，該研究通過GWAS鑒定到一個uORF的自然变异，该变异影響下遊GmPHF1的蛋白含量和空間分布，從而影響磷轉運蛋白GmPT4從內質網向細胞膜的轉移，最終形成大豆群體磷吸收效率的差異。
福建农林大学青年教师郭子龙副教授和在读博士生曹红瑞爲本文共同第一作者，廖红和陈志长教授爲共同通讯作者。福建农林大学孙丽莉副教授和华南农业大学的田江、王秀荣、赵静教授参与了此项工作。本研究得到国家重点研发计划、国家自然科学基金重点项目和青年项目的资助。
論文鏈接：
https://www.nature.com/articles/s41467-022-31555-2